（本文来源与Meta Neuro公众号，原创Lee H）

小胶质细胞是神经系统（CNS）中的主要巨噬细胞群体，在几乎所有CNS疾病的发病机制中起关键作用。肠道菌群可维持小胶质细胞的成熟和功能，其衍生物短链脂肪酸（SCFA），尤其是乙酸盐，能够使未成熟的小胶质细胞表型正常化。因此肠道和CNS的功能连接在肠-脑轴中概念化。然而，关于体内小胶质细胞代谢及肠道衍生物如何驱动免疫调节的细胞途径知之甚少。2021年11月，德国弗莱堡大学神经病理学研究所的Marco Prinz团队在《Cell Metabolism》（IF:31.373）杂志发表了一项研究。他们的研究从肠脑轴的角度出发，提出乙酸盐可调节小胶质细胞生理功能，塑造先天免疫机制吞噬Aβ改善AD。这项研究对于神经退行性疾病AD的机制阐述具有一定意义，为AD治疗提出了新的可能。

01 研究目的

■ 探究小胶质细胞的代谢变化

■ 探究小胶质细胞功能在稳态期间受到哪些宿主微生物群的影响

■ 探究肠道菌群衍生物乙酸盐如何驱动免疫调节及确切细胞途径

■ 探究乙酸盐调节小胶质细胞功能介导Aβ吞噬的机制研究

02 研究材料

WT小鼠、5xFAD小鼠（均在GF、SPF条件下饲养）

03 研究方法

●免疫荧光染色

●小胶质细胞的3-D重建

●小胶质细胞分离和流式细胞术

●代谢测定

●SCFA定量

●体内和体外¹³ C-乙酸盐示踪

●RNA测序

●基因表达分析

●染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和qPCR代谢谱分析

●草酰乙酸（OAA）测量

●蛋白质组学

●电镜

●Western blot 

04 研究结果

结果1

图1

1.  肠道菌群缺乏可导致小胶质细胞代谢相关基因H3K4me3和H3K9ac增强

对小鼠的小胶质细胞进行批量RNA测序（图1A）。与SPF小鼠相比，GF小鼠小胶质细胞差异表达基因分析（DEG）发现DNA损伤诱导转录物4（Ddit 4）和APOE的mRNA增加，II 1a和Ly 86的mRNA减少。IPA分析观察到GF小鼠中未成熟的小胶质细胞，其中免疫细胞增殖、细胞存活、巨噬细胞发育、细胞因子数量、代谢相关指标活性氧（ROS）等均表现出显著差异（图1B和1C）。ChIP-seq显示，GF小鼠H3K4me3的“细胞成熟减少、细胞数量增加”和H3K9ac的“细胞周期进展增加”、“细胞密度增加”（图1D-1I）。qRT-PCR证实GF小鼠的小胶质细胞中Ddit 4增加（图1J），其近端启动子中H3K4me 丰度升高（图1K）。蛋白质组学分析显示SPF和GF小鼠分离的小胶质细胞的功能和典型途径类别相似。这些数据表明，宿主微生物群的终身缺失导致基因表达的变化以及组蛋白乙酰化和甲基化标记的相关表观遗传学变化，这些变化发生在控制小胶质细胞增殖、形态、活化和控制代谢功能（包括线粒体密度）的基因的限定启动子区域。

结果2

图2

2.宿主微生物群缺乏改变小胶质细胞代谢谱

线粒体代谢功能可能受到宿主微生物群影响。代谢物的主成分分析（PCA）显示两组之间存在明显的分离（图2A）。GF小鼠的大多数小胶质细胞丰度增加，大量脂质和脂肪酸被耗尽（图2）。代谢物靶向分析显示组间比较存在显著差异。GF小鼠小胶质细胞中核酮糖5-磷酸增加，表明嘌呤代谢增加和核苷酸产生增加；三羧酸（TCA）循环的代谢产物，如2-酮戊二酸增加，苹果酸降低，OAA呈增加趋势，三磷酸腺苷（ATP）水平呈下降趋势。（图2C）。这些数据表明，宿主微生物的缺乏直接影响TCA循环和嘌呤代谢的要素以及小胶质细胞中的其他代谢途径（图2D）。

结果3

图3

3.宿主微生物群在体内平衡期间控制呼吸链复合物II（CII）的功能

GF小鼠小胶质细胞线粒体代谢紊乱。细胞外通量（Seahorse）分析显示两组小鼠细胞之间的耗氧速率存在微小差异，两组小胶质细胞都不具有任何备用呼吸能力（SRC），与其他巨噬细胞相比呈现相对低的代谢周转。糖酵解产生乳酸的量度即细胞外酸化率（ECAR）与葡萄糖的摄取显示组间比较结果相似。流式细胞术显示，与 SPF 小鼠的小胶质细胞相比，GF小鼠被 CD11b⁺CD45^low 标记的小胶质细胞体积更大、颗粒更丰富，脂质减少，线粒体ROS增多（图3A、3B、3F）。线粒体绿色荧光探针（MitoTracker green）测量显示线粒体含量显著增加（图3C），线粒体膜电位（Dcm）降低（图3D），但组间比较总细胞ROS和线粒体ROS阳性的小胶质细胞的百分比相似（图3E、图3F）。透射电子显微镜（TEM）量化小胶质细胞线粒体有丝分/裂的数量，GF小胶质细胞中线粒体数量增加（图3G和3H）。TMRM染色随时间测量Dcm，显示在复合物I（CI）被鱼藤酮（Rot）抑制之前，示组间比较均同等下降（图3I和3J）；添加CII底物琥珀酸盐(Succ)重建Dcm（图3 I和3 J）；抗霉素A1（AA1）抑制CIII使Dcm同等降低（图3 I和3 J），表明小胶质细胞Cl功能不受微生物群的影响。而GF小鼠的小胶质细胞中CII选择性损伤，组间比较SDHA（CII的主要组分）在小胶质细胞表达相等（图3K-3M），因此考虑GF小鼠的小胶质细胞内源性CII抑制剂水平升高导致其活性降低。同时发现OAA增加（图3N和2C），其能以剂量依赖性方式抑制SPF小胶质细胞中Succ诱导的CII活性（图3O和3P）。进一步探究GF小鼠出生后再分化是否能够调节小胶质细胞的特性。GF小鼠在出生后接触SPF供体小鼠8周。与GF小鼠相比，重新定殖的GF小鼠小胶质细胞显著减少（图3Q和3R），线粒体质量和Dcm在去磷酸化后恢复（图3S和3T），添加Succ后Dcm充分增加（图3U、3V）；3D重建显示，小胶质细胞体积减少， Tomm20+ 线粒体减少、体积不变（图 3W-3Y）。此外，出生后使用抗生素（ABX）处理细胞耗尽肠道细菌，施用Succ后小胶质细胞 Dcm 减少，这突显了肠道细菌和小胶质细胞相互作用使代谢特征呈动态和可塑性。

这些数据共同揭示了 GF 小鼠小胶质细胞在平衡状态下的 CII 活性缺陷以及线粒体网络组成的重大变化。

结果4

图4

结果5

图5

4.细菌衍生的乙酸盐可恢复稳定状态下小胶质细胞减弱的适应能力

乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐是细菌发酵产物，对小胶质细胞的成熟和稳态调节至关重要。但不同的SCFA是否仅协同作用于小胶质细胞或单独作用，需进一步探究。通过GF小鼠的饮用水向其提供SCFA的混合物，或单独的乙酸盐、丙酸盐或丁酸盐，持续4周。结果显示SCFA的混合物将GF中小胶质细胞密度降低至在正常，主要来源于乙酸盐校正小胶质细胞数量同时降低Ddit 4表达（图4A-4C）。分析揭示，仅混合SCFA或乙酸盐可逆转小胶质细胞比例的缺陷（图4D-4 E）。为了检查乙酸盐对小胶质细胞转录组谱的影响，从SPF、GF和GF（+乙酸盐）的小鼠中分离小胶质细胞，RNA-seq分析显示三组表达DEG具有显著差异（图4F和4G）。同时在GF小鼠小胶质细胞中观察到APOE和Ddit 4的表达上调，P2RY12表达降低，乙酸盐存在下可恢复（图4G），NFkB信号传导和免疫应答亦可恢复。

此外，SCFA的混合物和单独的乙酸盐可GF小鼠原本增多的线粒体数量正常化（图5A、5B、5C-5E）。同时GF小鼠补充乙酸盐后添加Succ可恢复小胶质细胞Dcm（图5 F和5G）。因此，乙酸盐可恢复CII相关的小胶质细胞功能障碍。

以上数据表明，肠道衍生物乙酸盐能够影响CNS细胞的生物学。质谱法检测显示GF小鼠CNS乙酸盐水平显著降低，口服乙酸盐处理后显著增加（图5H）。为了证明肠道细菌的存在增加了SCFA水平，结果显示sDMDMm 2小鼠（具有由12种选定的产乙酸盐细菌菌株组成的稳定的中等多样性小鼠微生物群）和SPF小鼠在血清中乙酸盐水平相当，而GF小鼠降低（图5I）。同时为了在体内特异性追踪肠来源的乙酸盐，我们通过口服管饲法向GF小鼠提供¹³ C-乙酸盐，6和12小时后测量脑、结肠、肝脏和血清中¹³C-标记的乙酸盐的摄入（图5J），结果显示均可观察到显著的¹³ C-乙酸盐。体外细胞实验显示CNS神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞都从培养基中获得乙酸盐（图5K），突出显示了小胶质细胞对乙酸盐的直接摄取和使用。因此小胶质细胞的属性和代谢功能是由肠源性乙酸盐控制的。

结果6

图6

结果7

图7

5.乙酸盐可独立调节神经退行性病变过程中的小胶质细胞功能

AD的发病机制与小胶质细胞密切相关。与SPF 5xFAD小鼠相比，小胶质细胞在GF 5xFAD小鼠中的表达和代谢活性更低，Aβ沉积减少。饮用水中添加乙酸盐后Aβ沉积增多、紧密接近的细胞减少，小胶质细胞的密度降低，DEG增多，与SPF 5xFAD结果相当（图6A-6G）。且在DEG中，刺激Aβ沉积的基因如Clec7a、Axl、Apoe、Itgax或Trem 2等表达增加（图6H）。IPA显示，GF 5xFAD小鼠干扰素信号传导较弱，糖酵解、细胞因子数量、炎症反应、吞噬细胞趋化性等均降低，相反TGF-β信号传导增强，补充乙酸盐可恢复（图6I - 6 N）。

形态学分析显示SPF、GF、GF（+乙酸盐） 5xFAD小鼠的TR⁺斑块相关小胶质细胞的形态学对比显示GF 5xFAD小鼠的小胶质细胞分枝更多、Tomm 20+线粒体的数量更高，补充乙酸盐可恢复（图7A-7C）。此外，GF条件下观察到较高百分比的甲氧基-O4（MXO 4⁺）小胶质细胞，乙酸盐补充后可恢复（图7D-7F），表明乙酸盐影响小胶质细胞对Aβ的吞噬。为了探究乙酸盐是否也能够在神经退行性病变调节小胶质细胞代谢，我们分析了小胶质细胞线粒体ROS的产生。5xFAD小鼠的MitoSox⁺ MXO4⁺小胶质细胞的百分比升高，GF 条件下显著增强，乙酸盐处理可恢复（图7G和7H）。体外培养原代小胶质细胞将其暴露于添加和不添加乙酸盐的Aβ中（图7I），结果显示添加乙酸盐时，Iba1⁺ Aβ⁺小胶质细胞的百分比显著降低，Cxcl 10、Ccl 5和Relb的基因表达上调（图7J、7K）。添加Aβ后的小胶质细胞能从培养基中摄取更多的乙酸盐（图 L），多出来的¹³ C-乙酸盐进入TCA循环的各种代谢物中（图7L-7M），表明部分乙酸盐为TCA循环提供燃料。

这些数据表明肠源性乙酸盐可调节AD模型5xFAD小鼠的小胶质细胞功能。

结论

乙酸盐是一种源自微生物的 SCFA，它能推动小胶质细胞的成熟并调节其平衡代谢状态。在阿尔茨海默病小鼠模型中，乙酸盐还能调节小胶质细胞对Aβ的吞噬作用以及疾病的进展。该研究尚处于早期阶段，乙酸盐在CNS的免疫平衡和紊乱期间的复杂作用机制还需进一步探索。

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